一、Real time PCR實驗 注意事項：

　　1. 實驗材料的處理和準備

　　在第一講 RNA 抽提中已經講過一些，還需要注意的是， 以最基本的基因表達差異分析為例，實驗材料分為對照組(CON)和處理組(TRT)。組內要有復孔，要有生物重復，這樣可以統計分析此處理是否有統計學意義。

　　2. 引物設計

　　一般Real-Time PCR 引物的設計遵循下面一些原則：

　　擴增產物長度在 80-150bp。

　　引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。

　　產物不能形成二級結構。

　　產物長度一般在 15-30 堿基之間。

　　G+C 含量在 40%-60%之間。

　　堿基要隨機分布。

　　引物自身不能有連續 4 個堿基的互補。

　　引物之間不能有連續 4 個堿基的互補。

　　引物 5’端可以修飾。

　　引物 3’端不可修飾。

　　引物 3’端要避開密碼子的第 3 位.

　　Taqman 探針的設計稍有不同，遵循以下原則：

　　盡量靠在上游引物;

　　長度 30-45bp，Tm 比引物高至少 5℃;

　　5’端不要是 G，G 會有淬滅作用，影響定

　　3. 常用的相對定量數據分析方法有：

　　雙標曲線法、ΔCt 法、2‐ΔΔCt法(Livak法 )、用參照基因的ΔCt 法。

　　雙標曲線法：每次實驗都分別用標準品做內參基因和目的基因的標準曲線， 并同時擴增各待測樣本中的目的基因和內參基因。然后使用標準曲線來計算待測樣本中的目的基因和內參基因的表達量。最后使用如下公式得出目的基因表達差異。

　　ΔCt 法：不用內參基因作為標準， 實驗設計簡單，數據分析處理簡單。 需要準確量化初始材料(如細胞數目或核酸微克數)，擴增效率為 100%。計算公式如下：

　　2‐ΔCt=2‐(實驗組 Ct‐對照組 Ct)

　　2‐ΔΔCt法：這是最常用的進行相對基因表達分析的方法，得到的結果是實驗組中目的基因相對于對照組中目的基因表達的差異倍數。要求目的基因和內參基因的擴增效率都接近 100%，且相對偏差不超過 5%。計算公式如下：

　　首先用內參基因的 Ct 值對實驗組(test)和對照組 (con)的靶基因 Ct 值進行歸一化：

　　ΔCt test=實驗組目的基因 Ct 值-實驗組內參基因 Ct 值

　　ΔCt con=實驗組目的基因 Ct 值-實驗組內參基因 Ct 值

　　隨后用對照組的Ct值歸一實驗組的ΔCt：

　　ΔΔCt=ΔCt test-ΔCt con

　　最后計算表達水平的差異倍數：

　　Change Fold=2‐ΔΔCt

　　用參照基因的ΔCt 法：這個方法的使用前提與2‐ΔΔCt法相同。計算方法如下：

　　對照組表達=2(對照組內參 Ct‐對照組目的基因 Ct)

　　實驗組表達=2(實驗組內參 Ct‐實驗組目的基因 Ct)

　　這種方法得到的對照組表達水平不是 1.0，但如果將得到的兩個表達值都除以對照組表達值，則得到：

　　對照組 Ratio=1

　　實驗組 Ratio

　　=2(實驗組內參 Ct‐實驗組目的基因 Ct)/ 2(對照組內參 Ct‐對照組目的基因 Ct)

　　=2‐[(實驗組目的基因 Ct‐實驗組內參基因 Ct)‐ (對照組目的基因 Ct‐對照組內參基因 Ct)]

　　=2‐(ΔCt test‐ΔCt con)

　　=2‐ΔΔCt

　　得到的比值與2‐ΔΔCt法是相同的，因此用參照基因的ΔCt 法是2‐ΔΔCt的一種變化形式。

PCR、western blot、ELISA的取舍?

　　PCR：檢測的是mRNA，在一些特定情況下mRNA變化不等同于蛋白變化，如蛋白降解等。此外，某些mRNA是一定可以翻譯成蛋白的，如miRNA、lncRNA、circRNA等，這種情況只能選擇PCR檢測RNA。此外，一些通路蛋白，如p65、β-catenin等，有較多轉錄后修飾方式，如磷酸化，這種發生于蛋白層面的變化PCR也是無能為力的。

　　推薦應用：臨床組織、動物組織標本的mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA檢測。

　　western blot：檢測蛋白表達或轉錄后修飾(磷酸化、剪切體、甲基化、蘇素化、泛素化、乙酰化、多聚體、降解等)，與其他實驗技術結合可以達到多種目的。應用最為廣泛。細胞和組織都可以應用，也可以通過提取不同亞細胞組成用于檢測蛋白的定位情況。為半定量實驗。

　　推薦應用：細胞或組織中通路蛋白、一般蛋白的表達或轉錄后修飾。

　　ELISA：為定量實驗，主要用于分泌型蛋白的檢測居多。也可以用于動物血清、組織、細胞上清的蛋白檢測。但是不適用于蛋白轉錄后修飾的檢測，不推薦通路相關蛋白的檢測。

　　推薦應用：細胞上清、組織、動物血清中分泌型蛋白，如細胞因子的檢測。

中析儀器 資質